Mirta Boban, Višnja Kirin, Arijana Vukičević
Hrvatski zavod za transfuzijsku medicinu
genetički biljezi trombofilije, real-time PCR
''7. Međunarodni kongres HDMSARIST-a''
Šibenik, 24.-27. travnja 2014. godine
Određivanje genetičkih biljega trombofilije radi se na uređaju AB 7500 real-time PCR
System (Applied Biosystems, USA) umnožavanjem dijelove gena uključenih u
genetske preuredbe kod mutacija genetičkih biljega trombofilije: FV Leiden (R506Q),
protrombin (G20210A), MTHFR/metilentetrahidofolat reduktaza (C677T),PAI-1polimorfizam 4G/5G plazminogen aktivator inhibitora-1.
Materijali i metode: Izolacija genomske DNA radi se na uređaju QIAcube pomoću
QIAamp DNA Blood Mini QIACube kita (Qiagen, Njemačka) iz 200 μL početnog
volumena pune krvi. Real-time PCR (RT-PCR) metodom alelne diskriminacije za
određivanje mutacije FV Leiden i protrombin radi se validiranim „in house“ testom uz
primere i probe preuzete iz literature, za MTHFR C677T koristi se TaqMan predesigned SNP genotyping assay, za ispitivanje PAI-1 polimorfizma koristi se Custom
TaqMan SNP genotyping assay (Applied Biosystems).
Rezultati: Nakon pripreme real-time PCR mješavina za određivanje genetičkih biljega
trombofilije, dodaju se uzorci s izoliranom DNA ispitanika i za procesnu kontrolu u
svaku seriju uzoraka negativna kontrola (umjesto DNA je bidestilirana voda) za
praćenje kroskontaminacije; te pozitivne kontrole za genotipove: „divlji“ (bez
mutacije), heterozigot (prisutnost mutiranog i divljeg alelnog gena), homozigot za
mutaciju. Uređaj se programira za odgovarajući program, redoslijed uzoraka upiše u
software uređaja koji se ispituju po stripovima za svaku pretragu. Stripovi s uzorcima
smjeste se u 96- mikrotitarsku pločicu uređaja AB 7500 Real-time PCR System. RTPCR testiranje traje oko 90 min. Podaci dobivene fluorescencije uzoraka analiziraju
se pomoću software-a uređaja. Dobiveni rezultati razvrstavaju se u grafu automatski
ili ručno prema osi X i osi Y odnosno u sredinu između dviju osi, na heterozigote,
homozigote, negativne kontrole i nedefinirane uzorke koje je potrebno ponoviti.
Dobiveni nalaz genetičkih biljega trombofilije upisuje se u kompjuterski sustav eDELPHYN, rezultat se validira te ispisuje nalaz.
Zaključak: Određivanje genetičkih biljega trombofilije pomoću RT -PCR-a metodom
alelne diskriminacije je vrlo specifična i brza metoda u odnosu na prije korištene
PCR-SSP i PCR-RFLP.